近日，真邁生物與合作單位華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在Journal of Applied Microbiology上發(fā)表了題為“Transcriptome analysis reveals the underlying mechanism for over-accumulation of alkaline protease in?Bacillus licheniformis”的研究成果。該研究基于GenoLab M高通量基因測(cè)序儀完成了堿性蛋白酶的高產(chǎn)菌株Bacillus licheniformis?AQ在50 L發(fā)酵罐全過(guò)程（8個(gè)時(shí)間段）的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以解析其高表達(dá)堿性蛋白酶機(jī)制。在發(fā)酵終點(diǎn)（48 h)時(shí)，堿性蛋白酶達(dá)到峰值（42,020 U/mL），其他時(shí)間點(diǎn)與這個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，得到各組差異表達(dá)基因。隨后取其各組差異表達(dá)基因的交集，得到61個(gè)基因，對(duì)它們的功能分析發(fā)現(xiàn)：這些基因的編碼蛋白主要參與了分解代謝過(guò)程、肽酶和抑制劑、伴侶和折疊催化等過(guò)程。
堿性蛋白酶(AprE)是一種重要的工業(yè)酶，廣泛應(yīng)用于食品加工、洗滌劑工業(yè)、皮革業(yè)、生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)、廢物處理、生物活性肽合成等領(lǐng)域。在全球范圍內(nèi)，AprE占據(jù)了50%以上的酶產(chǎn)業(yè)。然而，目前的AprE產(chǎn)量仍然不能滿(mǎn)足工業(yè)需求，導(dǎo)致了大規(guī)模工業(yè)酶短缺。因此，進(jìn)一步提高AprE產(chǎn)率具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。很多微生物都能合成AprE，而其中芽孢桿菌屬Bacillus具有明顯優(yōu)勢(shì)，它們屬于公認(rèn)安全菌株，其蛋白分泌能力強(qiáng)，易于培養(yǎng)，發(fā)酵周期短，工業(yè)發(fā)酵穩(wěn)健性強(qiáng)，基因修飾方便，例如B. licheniformis，可以敲除調(diào)控因子sig F，阻止芽孢形成，使得AprE的酶活提升20%，達(dá)到29,494 ± 1053 U/mL。安琪酵母股份有限公司擁有一株高產(chǎn)AprE的菌株，B. licheniformis?AQ，本次采集了50 L大罐發(fā)酵的8個(gè)重要時(shí)間點(diǎn)樣本測(cè)定了AprE的酶活等理化指標(biāo)，并提取RNA完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
01?AprE發(fā)酵過(guò)程中的基因表達(dá)模式
該研究的8份樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，一共得到242 M高質(zhì)量reads，檢測(cè)到3821個(gè)基因在發(fā)酵過(guò)程中表達(dá)，占菌株總基因的91.74%。顯然，發(fā)酵終點(diǎn)(48 h)時(shí)高表達(dá)基因最多(a)。由于AprE酶活在發(fā)酵終點(diǎn)(48 h)時(shí)最高，因此，以48 h作為對(duì)照，進(jìn)行差異表達(dá)基因（DEG）分析，24 h時(shí)DEG數(shù)目最多，其次是32 h(b)。七個(gè)比較組的DEG的交集一共涉及61個(gè)基因(c)。通過(guò)功能富集分析發(fā)現(xiàn)這61個(gè)基因主要參與生物過(guò)程，尤其是氨基酸、α -氨基酸、有機(jī)酸、有機(jī)氮化合物等眾多分解代謝過(guò)程(d)。而肽酶和抑制劑、伴侶蛋白和折疊催化(KEGG)和胞外區(qū)域(GO_Cellular component)等功能富集最為顯著。DEG中最多的功能是肽酶和抑制劑。高效的蛋白分泌和折疊是芽孢桿菌重組蛋白生產(chǎn)的關(guān)鍵。這些過(guò)程由轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的組分以及細(xì)胞內(nèi)和胞質(zhì)外的伴侶蛋白輔助完成。這部分富集分析結(jié)果也證實(shí)了在AprE發(fā)酵過(guò)程中分泌和折疊活性非?；钴S。
02??AprE發(fā)酵過(guò)程中的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
研究人員查閱文獻(xiàn)，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，一共挑選了30個(gè)蛋白，它們可能與AprE合成相關(guān)，通過(guò)與STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，繪制PPI（蛋白相互作用）網(wǎng)絡(luò)，最終得到了22個(gè)蛋白的網(wǎng)絡(luò)信息。Spo0A位于中心，擁有節(jié)點(diǎn)數(shù)最多(11個(gè))，其次是CodY (9個(gè))、sigH (9個(gè))和ArbB (8個(gè))。而這些蛋白的編碼基因表達(dá)量熱圖顯示，AprE基因的表達(dá)量在24 h達(dá)到峰值，隨后下降，在32 h達(dá)到第二高峰，隨后下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)略有上升。右下5個(gè)sigma因子的表達(dá)模式與AprE略有不同。
03?qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量
研究人員挑選了與AprE合成相關(guān)的20個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，包括芽孢形成的16個(gè)調(diào)控基因，4個(gè)全局調(diào)控基因。qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示：大多數(shù)基因在32 h時(shí)表達(dá)水平較高。而轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示大部分基因在24 h時(shí)表達(dá)水平較高，但未檢測(cè)到qRT-PCR數(shù)據(jù)。雖然qRT-PCR與RNA-seq數(shù)據(jù)存在一定差異，但大部分基因的表達(dá)趨勢(shì)是一致的，證明了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。
1.?該研究首先考察了B. licheniformis?AQ在工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)堿性蛋白酶的變化。結(jié)果表明，發(fā)酵過(guò)程中堿性蛋白酶不斷積累，在發(fā)酵48 h時(shí)達(dá)到最大值；
2.?發(fā)酵全過(guò)程的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示：表達(dá)量最高的基因在發(fā)酵結(jié)束時(shí)(48 h)最多；
3.?構(gòu)建了潛在的PPI網(wǎng)絡(luò)，并利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)AprE發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平進(jìn)行了驗(yàn)證。
Ji A, Zheng X, Yang W, et al. Transcriptome analysis reveals the underlying mechanism for over-accumulation of alkaline protease in Bacillus licheniformis[J]. Journal of Applied Microbiology, 2023: lxad319.