自2019年底新冠疫情爆發(fā)以來，海外疫情還在不斷持續(xù)和蔓延，國內(nèi)疫情偶有發(fā)生，多為境外輸入或與之相關(guān)。根據(jù)美國約翰斯·霍普金斯大學(xué)發(fā)布的新冠疫情最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，截至2021年10月17日上午8點(diǎn)，全球累計(jì)新冠確診病例近2.4億例，累計(jì)死亡病例超過480萬例。
圖1 全球新冠疫情統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)
（數(shù)據(jù)來源：https://coronavirus.jhu.edu/map.html）
新冠病毒是一種單鏈RNA病毒，核酸序列總長(zhǎng)約30Kb（不同毒株，長(zhǎng)度略有不同）。由于新冠病毒一直在不斷變異進(jìn)化，世衛(wèi)組織根據(jù)病毒株發(fā)現(xiàn)時(shí)間的先后順序，依次使用希臘字母對(duì)其命名。如：Alpha(α)、Beta(β)、Gamma(γ)、Delta(δ)、Lambda(λ)等，目前，Delta和Lambda為主流毒株。
圖2 新冠病毒進(jìn)化演變
（數(shù)據(jù)來源：https://nextstrain.org/ncov/gisaid/global）
至今，全球公開的新冠病毒序列已經(jīng)超過87萬條，當(dāng)疫情爆發(fā)，第一時(shí)間破解病毒全基因組序列，持續(xù)監(jiān)測(cè)毒株變異，明確毒株分型，對(duì)鎖定傳染源、控制傳播途徑和疫苗研發(fā)等都至關(guān)重要。
目前，市面上多家公司推出了基于多重PCR擴(kuò)增獲得新冠病毒基因組全長(zhǎng)序列的檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品，我們挑選了其中5款使用GenoLab M高通量基因測(cè)序平臺(tái)對(duì)其檢測(cè)性能進(jìn)行評(píng)估。
本次測(cè)試采用Synthetic SARS-CoV-2 RNA質(zhì)控品（Twist，貨號(hào)104533）作為模擬樣本，分組如下：
RNA組：梯度稀釋的Synthetic SARS-CoV-2 RNA質(zhì)控品；
RNA拭子組：梯度稀釋的Synthetic SARS-CoV-2 RNA質(zhì)控品加入咽拭子人源RNA。
我們對(duì)Ct值17-38的RNA組及RNA拭子組樣本進(jìn)行測(cè)序與數(shù)據(jù)分析以評(píng)估各試劑盒的檢測(cè)靈敏度和陽性預(yù)測(cè)值。
表1?測(cè)試總方案
注：采用C試劑盒對(duì)模擬樣本進(jìn)行多重PCR完成目標(biāo)區(qū)域的捕獲，其捕獲產(chǎn)物分別搭配了兩種不同品牌的轉(zhuǎn)座酶快速建庫試劑盒（C-1、C-2）來完成建庫
本次測(cè)試中主要包含了兩種不同的技術(shù)路線：
多重PCR捕獲+PCR建庫：采用一輪多重PCR來完成目標(biāo)區(qū)域的捕獲，其捕獲產(chǎn)物通過第二輪的PCR擴(kuò)增加上測(cè)序接頭來完成文庫構(gòu)建（A、B試劑盒,見表1）；
多重PCR捕獲+酶切建庫：采用一輪多重PCR來完成目標(biāo)區(qū)域的捕獲，其捕獲產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)座法或酶切連接法來完成文庫的構(gòu)建（C-1、C-2、GM-LDT試劑盒,見表1）。
圖3?技術(shù)路線
下機(jī)數(shù)據(jù)分析及檢測(cè)限
對(duì)不同試劑盒的RNA組樣本及RNA 拭子組樣本（Ct值17-38）的GenoLab M平臺(tái)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量、基因組覆蓋度、100×覆蓋度比例等參數(shù)的分析對(duì)比，根據(jù)“100×覆蓋度比例≥90%”確定本次測(cè)試的檢測(cè)限。
結(jié)果表明：
A試劑盒的兩組模擬樣本的檢測(cè)限均為Ct 34.25；
B試劑盒的RNA組樣本的檢測(cè)結(jié)果均未能滿足100×覆蓋度比例≥90%，RNA拭子組樣本的檢測(cè)限為Ct 28.07；
C-1試劑盒RNA組檢測(cè)限為Ct 30.28，RNA拭子組檢測(cè)限為Ct 28.43；
C-2試劑盒RNA組檢測(cè)限為Ct 32.81，RNA拭子組檢測(cè)限為Ct 29.46；
GM-LDT試劑盒RNA組檢測(cè)為Ct 33.88，RNA拭子組檢測(cè)限為Ct 35.93。
注：RNA拭子組中Ct 34.25樣本的比對(duì)率為54.98%，其中98.08%的unmapped reads比對(duì)到人的參考序列上
表2 Genolab M測(cè)序數(shù)據(jù)分析
注：在計(jì)算基因組覆蓋度及100×覆蓋度比例時(shí)，由于Synthetic SARS-CoV-2 RNA質(zhì)控品是由6個(gè)RNA片段組成（斷點(diǎn)位置：5K、10K、15K、20K、25K），斷點(diǎn)區(qū)域的擴(kuò)增效果差，因此導(dǎo)致覆蓋度比例會(huì)相應(yīng)降低
通過以上對(duì)比可知，A、C-1、C-2、GM-LDT 試劑盒在低病毒載量樣本（~Ct 30）中均能較好的滿足“100×覆蓋度比例≥90%”。當(dāng)存在人源RNA干擾時(shí)，B試劑盒RNA組與RNA拭子組樣本測(cè)試數(shù)據(jù)差異較大，可能人源RNA的存在對(duì)其試劑盒的性能有較大的影響。C-1試劑盒與C-2試劑盒的性能相當(dāng)。
綜合比較各試劑盒RNA組和RNA拭子組Ct值的中值[1]和檢測(cè)限值（Ct值26.5-35.93）測(cè)試數(shù)據(jù)的基因組覆蓋均一性，如下圖所示，C-1、C-2、GM-LDT 試劑盒的基因組覆蓋均一性優(yōu)于A試劑盒和B試劑盒。
圖4 基因組覆蓋均一性
如下表所示，A、C-1、C-2、GM-LDT試劑盒在中值組中的檢測(cè)靈敏度與陽性預(yù)測(cè)值均大于90%，在檢測(cè)限組，除A試劑盒外，C-1、C-2、GM-LDT 試劑盒的檢測(cè)靈敏度與陽性預(yù)測(cè)值均大于90%。相比之下，B試劑盒的檢測(cè)靈敏度與陽性預(yù)測(cè)值相對(duì)較差。
表3?靈敏度與陽性預(yù)測(cè)值
注：Synthetic SARS-CoV-2 RNA質(zhì)控品中含有30個(gè)陽性位點(diǎn)
基于A、B、C-1、C-2、GM-LDT 試劑盒的測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果如下圖所示，幾款試劑盒檢測(cè)的結(jié)果與Synthetic SARS-CoV-2 RNA質(zhì)控品能準(zhǔn)確的聚類到一個(gè)分支，且C和GM-LDT結(jié)果與質(zhì)控品距離最近。
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綜合比較A、B、C-1、C-2、GM-LDT 試劑盒的檢測(cè)限值數(shù)據(jù)，其結(jié)果詳情如下：
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